Estructura de los acidos nucleicos. DNA

Nucleína

En 1871 Friedrich Miescher  publicó un método para separar el núcleo celular del citoplasma.

A partir de esos núcleos celulares extrajo un material ácido, nucleína, que contenía una cantidad extraordinariamente  grande  de fosforo y q, en contraste con las proteínas, no contenía azufre. La conclusión de Miescher fue que esta sustancia era única y no comparable con ningún otro grupo conocido hasta el momento.

En los años posteriores, se encontró que la nucleína, ahora denominada acido nucleíco, estaba asociada con varias proteínas en combinaciones denominadas nucleoproteínas. En la fracción proteica, se encontraban dos tipos de cantidades significativas: protamina, en el esperma de peces e histonas en otros núcleos. Aunque las histonas parecían ser relativamente complejas, la protamina tenia una estructura polipeptídica sencilla constituida principalmente por el aminoácido arginina.

La porción de acido nucleíco, era una característica constante para todas las células y contenía una variabilidad muy superior a la de la protamina.

Nucleótidos

Levene (1869-1940) demostró que al separar el acido nucleíco de la proteína, este podía descomponerse en fracciones mas pequeñas denominadas nucleótidos. Cada nucleótido estaba formado por distintos componentes químicos: un azúcar, un grupo fosfato y una porción nitrogenada denominada una base. El azúcar contenía cinco carbonos y se denominaba ribosa. Cuando a la ribosa le faltaba un átomo de oxigeno en el carbono 2´, se denomina desoxirribosa (Fig. 4-1) . Aunque estos son los azucares principales que se encuentran en los ácidos nucleícos, cualquier acido nucleíco en  particular normalmente no contiene ambos azucares a la vez. Como consecuencia hay dos tipos de ácidos nucleícos: acido ribonucleico (RNA), que se encuentra por lo general en el citoplasma y acido desoxirribonucleico (DNA), que se encuentra solamente en el núcleo con pocas excepciones.

En ambos ácidos nucleícos se encuentra un grupo fosfato unido a la posición 5´del azúcar (Fig. 4-2) . El termino ácido con que se denomina a estos compuestos hace referencia a que los nucleótidos son esteres del acido fosfórico.

Fig.4-1 Union de un grupo fosfato y una desoxirribosa produciendo un azùcar fosfato.

Además del azúcar y de los grupos fosfato que son componentes constantes de todos los nucleótidos en un ácido nucleíco, también esta presente un grupo nitrogenado mucho mas variable, asociado con cada azúcar por la posición del carbono 1. La unidad nitrogenada contiene uno o dos anillos con nitrógeno y carbono que podría funcionar como una base.

Las bases que contienen un solo anillo de carbono-nitrógeno son las pirimidinas, y las bases con dos anillos son las purinas. En el DNA las dos pirmidinas principales que se encuentran son la citosina y la timina, mientras que en RNA lleva citosinas y uracilo.

La diferencia entre timina y uracilo ( la presencia de un grupo metilo CH3, en lugar de un hidrogeno H, en la posición numero 5 en la timina) es significativa, de modo que la timina no se encuentra normalmente en el RNA ni el uracilo en el DNA. Las dos purinas principales, adenina y guanina, se encuentran tanto en el DNA como en el RNA.

Estructura del ADN

Chargaff y otros habían demostrado como regla que el numero de bases puricas (A + G) era igual al numero de bases primidínicas  (T + C ): que había  una equivalencia entre bases portadoras de grupos amino en las posiciones 6 ó 4 (A + C) y las bases portadoras de grupos cetos en estas posiciones ( T + C); y que las porciones de adenina a timina y de guanina a citosina se aproximaban muy cercanamente a 1 en distintas especies eucariotas investigadas . Estas equivalencias fueron consideradas por algunos investigadores como indicativas de una relación simétrica entre las bases nucleotídicas. Al principio de los años 50, los estudios del DNA realizados con rayos-X por Wilkins, Franklin y otros indicaban que se trataba de una fibra organizada, multicatenaria de alrededor de 22 angstroms de diámetro que también se caracterizaba por la presencia de grupos separados 3,4 angstroms a lo largo de la fibra y una unidad repetida cada 34 angstroms.

El DNA esta formado por dos cadenas de polinucleotidos enrolladas una alrededor de la otra para formar una doble hélice a derechas (Fig. 17-2). La estructura del DNA es tan característica que con frecuencia a esta molécula se le denomina la doble hélice. Como se ha descrito, cada nucleótido monomérico del DNA esta formado por una base nitrogenada (púrica o pirimidínica), un azúcar desoxirribosa y fosfato. Los mononucleótidos están unidos mediante enlaces 3´5- fosfodiéster. Estos enlaces unen el grupo 5´- hidroxilo de la desoxirribosa de un nucleótido con el grupo 3´- hidroxilo de la unidad azúcar de otro nucleótido mediante un grupo fosfato (Fig. 17-3)

Fig. 17-2

                                                   a                       b

Dos modelos de la estructura del DNA

a)    La doble hélice del DNA se representa como una escalera de caracol. Los lados de la escalera representan los esqueletos azúcar-fosfato. Los peldaños representan los pares de bases. B) En el modelo de relleno espacial, los esqueletos azúcar-fosfato están representados por hilos de esferas coloreadas. Los pares de bases constan de disposiciones horizontales de esferas azul oscuro. Los surcos amplio y estrecho se crean al enrollarse las dos cadenas una alrededor de la otra.

Fig. 17-3 Estructura de una cadena de DNA

En cada cadena de DNA los residuos de desoxirribonucleotidos están conectados mediante enlaces 3`-5 fosfodièster.

  La orientación antiparalela de las dos cadenas de  polinucleotidos permite que se formen enlaces de hidrogeno entre las bases nitrogenadas que están orientadas hacia el interior de la hélice . Existen dos clases de apareamiento de bases (pb) en el DNA: (1) la adenina (una purina) se aparea con la timina (una pirimidina) y (2) la purina guanina se aparea con la pirimidina citosina. Debido a que cada par de bases esta orientado en ángulo con el eje largo de la hélice, la estructura global del DNA se parece a una escalera de caracol.

Se han medido con precisión las dimensiones del DNA cristalino:

1.- Una vuelta de la doble hélice ocupa 3.4 nm y esta formada por aproximadamente 10.4 pares de bases.

2.- El diámetro de la doble hélice es 2.4 nm. Obsérvese que el espacio interior de la doble hélice solo es adecuado para el apareamiento de una purina y una pirimidina. El apareamiento de dos pirimidinas crearía un hueco y el apareamiento de purinas desestabilizaría la hélice.

3.- La distancia entre los pares de bases adyacentes es de .34 nm.

Modelos del DNA

El DNA es actualmente un icono cultural, un sinónimo de almacenamiento y recuperación de la información.

La composición química del DNA la determino en gran medida Albrecht Kossel entre 1882 y 1897, y P.A.Levene en los años 1920 cuando se descubrieron  las técnicas analíticas adecuadas. Desafortunadamente, Levene creyó erróneamente que el DNA era una molécula pequeña y relativamente sencilla. Su concepto, que se denominó hipótesis del tetranucleótido, retraso  significativamente más investigaciones del DNA.

En 1928, mientras estaba investigando una epidemia mortal de neumonía en Gran Bretaña, Fred Griffith realizó una serie notable de experimentos con dos cepas de neumococos. Una cepa bacteriana, que se denominaba la forma lisa (o el tipo L) debido a que estaba recubierta con una capsula de polisacárido, es patógena. La forma rugosa (o tipo R) carece de la capsula y no es patógena. Griffith observo que los ratones inoculados con una mezcla de las bacterias R vivas y las L destruidas por el calor, morían. Quedo asombrado cuando aisló las bacterias L vivas de los ratones muertos (Fig. 4-13). Aunque esta transformación de las bacterias R en bacterias L se confirmo en otros laboratorios, el descubrimiento de Griffith se recibió con un escepticismo considerable. (El concepto de transmisión de la información genética entre las células bacterianas no fue aceptado hasta los años 1950).

Fig. 4-13 Experimento de transformaciòn de Griffith

En 1944, Oswald Avery y sus colegas Colin MacLeod y Maclyn McCarty comunicaron su cuidadoso aislamiento e identificación del DNA como el agente transformador de los experimentos de Griffith. Avery y MacCarty demostraron posteriormente  que la digestión del DNA por la desoxirribosa (DNasa) inactivaba al agente transformador. (Finalmente se determino que  el DNA que transforma los neumococos R en la forma L codifica una enzima necesaria para sintetizar la capsula gelatinosa de polisacárido. Esta capsula protege a las bacterias del sistema inmunitario del animal y aumenta la adherencia y colonización de los tejidos del hospedador)

 (Fig. 4-14). Experimento de Avery, MacLeod y MacCarty

Otro experimento que confirmo que el DNA es el material genético fue realizado por Alfred Hershey y Martha Chase en 1952. Utilizando el bacteriófago T2, Hershey y Chase demostraron las funciones independientes del acido nucleíco y de las proteínas del virus. (Los bacteriófagos, que también se denominan fagos, son un tipo de virus que infectan a las bacterias). Cuando el fago T2 infecta una célula de Escherichia coli, obliga a la bacteria a sintetizar varios cientos de virus nuevos (Fig. 4-15). A los 30 minutos de la infección de la célula muere al romperse, liberando la progenie vírica. En la primera fase de su experimento, Hershey y Chase incubaron bacterias infectadas  con el fago T2 en un medio de cultivo que contenía 35 S (para marcar la proteína) y 32 P (para  marcar el DNA). En la segunda fase, se recogía el virus  marcado radiactivamente y se le permitía que infectara bacterias sin marcar. Inmediatamente después, el cultivo de bacterias infectadas  se sometía a fuerzas de cizallamiento en una trituradora. Este tratamiento eliminaba  el fago de sus lugares de unión  en la superficie externa en la pared de la célula bacteriana. Tras la separación de las partículas víricas vacías mediante  centrifugación, se analizaba la radiactividad de las bacterias.

Se encontró que las células contenían 32 P (confirmando así el papel del DNA en la transformación de las bacterias en productoras de virus), mientras que la mayoría del 35 S permanecía en el sobrenadante.

Fig. 4-15

Modelo de Watson y Crick

La estructura descubierta por Watson y Crick, que se denomina DNA B, representa la sal sódica del DNA en unas condiciones de humedad elevada. El DNA puede asumir diferentes conformaciones debido a que la desoxirribosa es flexible y a que giran los enlaces glucosídicos C´- N.

Cuando el DNA se deshidrata parcialmente, sume la forma A (Fig. 17-10 ). En el DNA A, los pares de bases no se encuentran formando ángulos rectos con el eje de la hélice, sino que se doblan 20° alejándose de la horizontal.

Fig. 17-10  

DNA A, DNA B y DNA Z

Como el DNA es una molécula flexible, puede adoptar diferentes configuraciones, dependiendo de su secuencia de pares de bases y las condiciones en que se realice su aislamiento.

Además, la distancia  entre los pares de bases adyacentes esta ligeramente reducida con 11 pb por vuelta de la hélice, en lugar de los 10.4 pb que se encuentra en la forma B. Cada vuelta de la doble hélice se produce en 2.5 nm, en lugar de 3.4 nm, y el diámetro de la molécula se hincha hasta aproximadamente 2.6 nm desde los 2.4 nm que se observan en el DNA B. La forma A del DNA se observa cuando se extrae con disolventes como el etanol. El significado del DNA A en las condiciones celulares es que la estructura de los dúplex de RNA y los dúplex de RNA/DNA que se forman durante la transcripción se asemejan a la estructura del DNA A.

La forma Z del DNA (que se llama asi por su conformación en zigzag se aparta radicalmente de la forma B. El DNA Z (D= 1.8 nm), que es considerablemente mas delgado que el DNA B (2.4 nm), esta enrollado en un espiral a izquierdas con 12 pb por vuelta. Cada vuelta del DNA Z, se produce en 4.5 nm, en comparación  con los 3.4 nm del DNA B. Los segmentos de DNA con bases púricas y pirimidínicas  alternas (especialmente CGCGCG) son los que con mayor probabilidad adoptan la configuración Z. En el DNA Z, las bases se apilan con un patrón dimérico  dispuesto a izquierdas, lo cual proporciona la apariencia de zigzag del DNA y su superficie plana sin canales. Las regiones del DNA con abundantes repeticiones CG frecuentemente son reguladoras, y unen proteínas específicas que inician o bloquean la transcripción.

Se ha observado  que algunos segmentos de moléculas de DNA tienen diversas estructuras de orden superior, entre las que se encuentran las cruciformas, las triples hélices y los superenrollamientos.

Los cruciformas sin estructuras en forma de cruz. Suelen formarse cuando una secuencia de DNA contiene un palíndromo (Un palíndromo es una secuencia que proporciona la misma información ya se lea hacia delante o hacia atrás).Las secuencias de DNA que forman palíndromos, que pueden constar de  algunas bases o miles de bases, se denominan repeticiones invertidas.

 En determinadas circunstancias (p. ej., pH bajo), una secuencia de DNA que contiene un segmento largo de una cadena de polipurina que forma enlaces de hidrogeno con una cadena de polipirimidina puede formar una tripe hélice .

La formación de la triple hélice,  que también se denomina DNA H, depende de la formación de apareamientos de bases no convencionales (apareamientos de Hoogsteen), que se producen sin romper los pares de bases de Watson-Crick. No se conoce cual es el significado del DNA H. Sin embargo, el DNA H  puede participar en la recombinación genética.

Superenrollamiento

El superenrollamiento del DNA, que en un tiempo se considero un artefacto de las técnicas de extracción del DNA, se sabe en la actualidad que facilita diversos procesos biológicos. Entre los ejemplos se encuentran el empaquetamiento del DNA en una forma compacta, así como la replicación y la transcripción del DNA.

Debido a que el superenrollamiento del DNA es un proceso dinámico tridimensional. Se deposita sobre una superficie plana una larga molécula lineal de DNA. Tras juntarse los extremos, se sellan para formar un circulo sin arrugas (Fig. 17-13).

Fig.17-13

a                                    b

Debido a que esta molécula esta sellada sin infraenrollamiento o sobreenrollamientos, se dice que la hélice esta relajada y permanece plana sobre una superficie. Si la molécula circular de DNA relajada  se sujeta y se enrolla unas pocas veces, adopta la forma que se muestra en la Figura 17-13b. Cuando esta molécula enrollada se vuelve a depositar sobre la superficie plana, gira para eliminar el enrollamiento. Sin embargo, considere lo que sucede si esta molécula se corta antes de enrollarse. (Las enzimas que realizan esta función en las células, que se denominan topoisomerasas).

Cuando el DNA esta infraenrollado, se enrolla a derechas para aliviar la tensión y se produce un superenrollamiento negativo. Cuando el DNA esta sobreenrollado, se enrolla a izquierdas para aliviar la tensión y se produce un superenrollamiento positivo. Cuando el DNA esta superenrollado negativamente, normalmente se enrolla sobre si mismo para formar un superenrollamiento enlazado . El DNA superenrollado  positivamente se encuentra normalmente donde el DNA se enrolla alrededor de un centro proteico para formar un superenrollamiento toroidal.

Cuando una molécula de DNA superenrollada negativamente se fuerza sobre un plano, se reintroduce la tensión aliviada por la formación del superenrollamiento negativa. Durante la replicación, las topoisomerasas mellan el DNA para aliviar la tensión de torsión de forma que pueda producirse la replicación. El superenrollamiento negativo del DNA explica también la propesión de determinadas secuencias de DNA para formar cruciformas y DNA H.

 De  esquemática de los experimentos de Hershey y Chase. Experimentos separados resultantes del marcaje de bacteriófagos T2 ya fuera con S35 (proteína) o con P32 (DNA). Cuando estos fagos marcados infectaban células sin marcar se encontró que la mayoría del DNA marcado estaba dentro de la bacteria y la mayoría de su proteína marcada se encontró fuera.

Replicación

La transmisión de información implica que el ADN es capaz de duplicarse de manera de obtener dos moléculas iguales a partir de la molécula inicial. Este proceso se llama replicación.
Luego del descubrimiento de la estructura del ADN, en 1957, dos biólogos moleculares americanos, Matthew Stanley Meselson y Frank Stahl demostraron que este se replica de una manera semiconservativa, es decir que la nueva cadena se sintetiza utilizando una de las hebras preexistentes como molde. Las moléculas de ADN “hijas” están formadas por una cadena nueva y una original que sirve como molde. Con nitrógeno 15 (un isótopo radiactivo), ya que el nitrógeno es necesario para la síntesis de las bases que componen el ADN, y usando sucesivas generaciones de bacterias Escherichia coli, estos científicos mostraron que cuando el ADN se duplica, cada una de sus cadenas pasa a las células hijas sin cambiar y actúan de molde o patrón para formar una segunda hebra y completar así las dos doble cadenas.
Para que esto ocurra, la célula debe “abrir” la doble cadena de ADN en una secuencia específica denominada origen de replicación(en bacterias) o secuencia de replicación autónoma (en eucariotas) y copiar cada cadena.
En la replicación participan varias enzimas. Las ADN polimerasas sintetizan una nueva cadena de ADN. Para esto utilizan como molde una de las hebras y un segmento corto de ADN, al que se le agregan los nuevos nucleótidos. Este segmento funciona como cebador (primer, en inglés). La ADN polimerasa agrega nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en crecimiento.

Figura 1. Replicación del ADN. La enzima ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN agregando un nucleótido al extremo 3’ (en el cual hay un OH).

La ADN polimerasa copia la cadena molde con alta fidelidad. Sin embargo, introduce en promedio un error cada 10⁷ nucleótidos incorporados. Tiene, además, la capacidad de corregir sus propios errores, ya que puede degradar ADN que acaba de sintetizar.

Otras enzimas que participan en este proceso son: la ADN primasa (que sintetiza el primer de ARN), la ADN ligasa (que une extremos 5’ con 3’ que hayan quedado luego de la síntesis), la ADN helicasa y las ADN topoisomerasas ADN (que evitan que el ADN se “enrede” en el proceso), las roteínas de unión al ADN (facilitan la apertura de la doble hebra).





Traducción

Ciertos genes producen otro tipo de ARN llamado ARNt (ARN de transferencia). Cada ARNt esta compuesto aproximadamente de 80 nucleótidos, que estan dispuestos en forma de una hoja de tébol. El ARNt se combina con aminoácidos y los lleva al ARNm.
Hay tantas clases diferentes de móleculas de ARNt como codones de ARNm. Cada ARNt se combina con un solo tipo de aminoácido (código genético). Un extremo de la molécula de ARNt se combina con el aminoácido por medio de una enzima y ATP,  mientras el otro extremo tiene un grupo de tres bases expuestas llamado anticodón, las cuales son complementarias a las tres bases del codón en el ARNm.
Cuando se inicia la síntesis de proteínas, el ARNm se asocia con los ribosomas y desempeñan las siguientes funciones:
Los ribosomas se unen al ARNm donde empieza el mensaje genético.
El desfase de una sola base nitrogenada en la lectura significa la síntesis de una proteína totalmente diferente de la codificada.

Los ribosomas sirven como soporte de ensamble de los codones del ARNm y de los anticodones de los aminoácidos del ARNt.

Los ribosomas contribuyen a catalizar la síntesis proteíca; este proceso implica una o más enzimas insolubles que forman parte del mismo ribosoma.

Los ribosomas se desplazan sobre la cadena del ARNm, leyendo en orden cada triplete de dicho "mensaje".
Los ribosomas detectan la terminación de un mensaje y efectúan la liberación de la nueva proteína sintetizada.

Transcripción

Cuando las dos cadenas de ADN se separan o desenlazan en los puentos de hidrogeno  en presencia de algunas enzimas y ATP, los nucleotidos de ARN que se encuentran dispersos en el núcleo  se aparean con las bases del ADN, enlazandose guanina con citosina o viceversa, y adenina con uracilo. Así formada, esta molecula de ARN es una copia fel del modelo de ADN sobre el cual fue ensamblando.

La nueva molécula de ARNm se separa del ADN, el cual une sus cadenas nuevamente.

Una molecula de ARNm es un sola cadena de nucleótidos, con una secuencia de sus bases determinada por la secuencia de las bases del ADN. Por tanto, los codones del ADN son transcritos a los codones del ARNm por lo que el proceso de transferencia del código  del ADN al ARNm se conoce como transcripción, y es la enzima ARN polimerasa la que la realiza.

Después que se ha hecho esto, el ARNm abandona el núcleo y se asocia con los ribosomas.